Thermo Scientific™ Polinucleótido quinasa T4 (10 U/μl)

Descripción

T4 Polynucleotide Kinase (T4 PNK) cataliza la transferencia del fosfato gamma del ATP al grupo 5'-OH de ARN o ADN monocatenario o bicatenario y a oligonucleótidos o nucleósido 3'-monofosfatos (forward reaction). La reacción es reversible. En presencia de adenosina-5'-difosfato (ADP), el polinucleótido cinasa T4 exhibe actividad 5'-fosfatasa y cataliza el intercambio de los grupos fosfatos entre 5'-P-oligo-polinucleótidos y ATP (reacción de intercambio).

La enzima es también 3'-fosfatasa.

• Activa en tampón de enzimas de restricción, RT y ligasa de ADN T4.
• Fuente: Células E. coli con un gen pseT clonado del bacteriófago T4
• Peso molecular: La enzima es un homotetrámero. Consta de cuatro subunidades idénticas de 28,9 kDa

• Ausencia de otras endo o exodesoxirribonucleasas y ribonucleasas confirmada mediante pruebas de calidad apropiadas Probado funcionalmente para marcar extremos 5' de ADN

• Células E. coli con un gen pseT clonado del bacteriófago T4

• La enzima es un homotetrámero. Consta de cuatro subunidades idénticas de 28,9 kDa

• Una unidad de la enzima transfiere 1 nmol de fosfato-gamma de ATP a 5',-OH de ADN en 30 min a 37 °C.
• La actividad enzimática se analiza en la siguiente mezcla: 100 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM de MgCl₂, 5 mM de DTT, 0,5 mM de 5',-OH de ADN, 0,05 mM de ATP y 0,1 MBq/ml [gamma-³³P]-ATP

• La enzima se suministra en: 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM de KCl, 0,1 mM de EDTA, 2 mM de DTT y 50 % (v/v) glycerol
• Tampón de reacción A 10X (para reacción directa): 500 mM de Tris-HCl (pH 7,6 a 25 °C), 100 mM de MgCl₂, 50 mM de DTT, 1 mM de espermidina
• Tampón de reacción B 10x (para reacción de intercambio): 500 mM de imidazol-HCl (pH 6,4 a 25 °C), 180 mM de MgCl₂, 50 mM de DTT, 1 mM de espermidina y 1 mM de ADP
• Solución PEG al 24 %: Polietilenglicol 6000 al 24 % (p/v)
Inhibición e inactivación:
• Inhibidores: quelantes de metales, iones de amonio y fosfato, KCl y NaCl a una concentración superior a 50 mM
• Inactivación por calor a 75 °C durante 10 min o añadiendo EDTA

Recomendada para:

Marcado del extremo 5' de los ácidos nucleicos (3, 4) que pueden usarse como sondas para hibridación, sondas para cartografía de transcripción, marcadores para electroforesis en gel, primers para la secuenciación del ADN, primers para PCR; fosforilación del extremo 5' de oligonucleótidos, productos de PCR, u otros fragmentos de ADN o ARN antes de la ligación; fosforilación de primers para PCR; detección de modificaciones del ADN mediante postmarcaje con [32P] (5, 6); eliminación de los grupos fosfato en el extremo 3' (2)

Nota:

El polietilenglicol (PEG) y la espermidina mejoran la velocidad y la eficiencia de la reacción de fosforilación (7). El PEG se utiliza en la mezcla para la reacción de intercambio. Como los iones amonio inhiben la T4 Polynucleotide Kinase, utilice acetato sódico para precipitar el ADN antes de la fosforilación (1, 2).