Recursos

R. El tipo de tampón utilizado para analizar ADN en electroforesis en gel de agarosa depende principalmente del tamaño del fragmento de ADN y la aplicación posterior a la electroforesis. Dos tampones habitualmente utilizados para la electroforesis de agarosa de ADN son Tris-acetato con EDTA (TAE; 40 mm de Tris-acetato, 1 mm de EDTA) y Tris-borato con EDTA (TBE; 89 mm de Tris-borato, 2 mm de EDTA). Debido a que el pH de estos tampones es neutro, la cadena de fosfato de ADN tiene una carga neta negativa y migra hacia el ánodo.

Los tampones TAE y TBE tienen propiedades diferentes, que los hace más aptos que ningún otro para fines específicos. Para fragmentos de ADN más grandes (>10 kb) es preferible el TAE. Para fragmentos de ADN más pequeños (<1 kb) es preferible habitualmente el TBE, ya que tiene una mayor capacidad de tamponado y ofrecerá una resolución más nítida que el TAE. El TAE también es la opción preferible de tampón cuando la muestra de ADN se va a utilizar en experimentos de clonación, ya que el borato del tampón TBE es un potente inhibidor de muchas enzimas.

R. El grosor recomendado para el gel de agarosa es entre 3 y 4 mm. Los geles con un grosor superior a 5 mm darán como resultado bandas difusas

A. El gel de agarosa con grado de biología molecular Fisher Bioreagents, ref. 10766834, se adapta bien a la separación rutinaria de ADN y ARN en el rango de 500 bp a 23 kb. Para la separación de fragmentos en el rango de 100 a 2000 bp, sugerimos utilizar Fisher Bioreagents, ref. 10766834, que aumenta la concentración del gel (>2 %) y con el tampón TBE (no el TAE).

R. El ensayo cometa (electroforesis en gel de células individuales) es un método sencillo utilizado para medir roturas de la cadena de ADN en las células eucariotas. Habitualmente se utiliza agarosa con un punto de fusión bajo. Sugerimos utilizar la agarosa de grado de biología molecular Fisher Bioreagents, ref. 10377033, puesto que tiene un punto de fusión bajo, y resulta es ideal para separar y recuperar ácidos nucleicos.

R. No debe cargar más de 100 ng de ADN. Esta cantidad debe proporcionarle una banda clara y bien definida al teñirse con bromuro de etidio y visualizarse con luz UV. Si carga demasiado ADN, solo verá una mancha.

P. Los tintes de carga en el tinte de carga en gel de agarosa (6X) Fisher Bioreagents, ref. 10205023, son una combinación exclusiva de tres tintes de rastreo que hacen que la estimación de la migración de la muestra sea simple y fiable:

• Tinte n.º 1: un tinte azul celeste que migra a alrededor de 4000 pares de base en un 1 % de agarosa
• Tinte n.º 2: un tinte añil que migra a alrededor de 600 pares de base en un 1 % de agarosa
• Tinte n.º 3: un tinte magenta que migra a alrededor de 10 pares de base en un 1 % de agarosa

R. La tensión recomendada es entre 4 y 10 V/cm (cm se determina midiendo la distancia entre electrodos, es decir, la distancia entre el ánodo y el cátodo, no la longitud del gel) en condiciones electroforéticas normales. Si la tensión es demasiado baja, la movilidad del fragmento de ADN pequeño (<1000 bp) se ve reducida y se producirá un ensanchamiento de la banda debido a la difusión. Si la tensión es demasiado alta, la resolución de la banda se verá reducida, principalmente debido al sobrecalentamiento del gel.

R. La recirculación evita la formación de gradientes de pH y la reducción del tampón, de manera que se aconseja hacer recircular el tampón, especialmente durante electroforesis prolongadas. La recirculación del tampón también es importante al analizar geles de TAE más grandes debido a la menor capacidad de tamponado del TAE.

R. Hay bolsas decolorantes de bromuro de etidio: Fisher Bioreagents, ref. 12861680. Estas bolsas eliminarán hasta 5 mg de bromuro de etidio al agitarse con la solución por la noche. Sin embargo, puesto que las normativas de eliminación varían, póngase en contacto con su oficial de seguridad local para obtener las directrices de eliminación.

R. No disponemos de información relativa a la cantidad de ADN de cada fragmento discreto (banda) de la escalera de ADN Fisher Bioreagent, ref. 10284633, de baja escala (100 bp). Esta escalera de ADN está diseñada para ser un patrón de determinación de tamaño de uso general como los amplicones PCR* separados en el minigel de agarosa. No está concebida para utilizarse como estándar cuantitativo. Sin embargo, para la cuantificación, disponemos de las escaleras de ADN exACTGene como Fisher Bioreagents, ref. 10021463. Esta escalera de ADN con rango bajo proporciona la cantidad aproximada de ADN en cada banda.

R. Debe prestarse atención al seleccionar el porcentaje de acrilamida o el tamaño de poro del gel que se va a utilizar. La siguiente tabla detalla qué porcentaje de gel se utiliza para separar los tamaños de proteínas indicadas.

Porcentaje de acrilamida	Resolución de la separación
5%	60 to 220kDa
7.5%	30 to 120kDa
10%	20 to 75kDa
12%	17 to 65kDaa
15%	15 to 45kDa
17.5%	12 to 30kDa

R. Para la electroforesis en gel de proteínas, hay disponibles tampones de carga de muestra habituales en formulación reductora o no reductora. El ditiotreitol (DTT) es un agente reductor habitual utilizado en los tampones de muestra de proteínas. La formulación del tinte de carga de gel de proteínas (2X) Fisher Bioreagents, ref. 10376363, no contiene un agente reductor como DTT.

A. No se aconseja esterilizar en autoclave el Fisher Bioreagent, ref. 10204733, 10X PBS, ya que el fosfato podría precipitarse fuera. Para este producto, filtramos la solución del tampón a través de un filtro de 0,2 micras en un frasco de polímero de 1 l bajo una campana estéril.

R. La formulación de la solución 10X de tampón fosfato salino (PBS) Fisher Bioreagents, ref. 10649743, es la siguiente:

• 1,37 M de cloruro de sodio
• 0,027 M de cloruro de potasio
• 0,119 M de tampón fosfato

El tampón fosfato se compone de dos componentes, a saber: 0,101 M de fosfato de sodio dibásico heptahidrato (CAS n.º 7782-85-6) y 0,018 M de fosfato de potasio monobásico (CAS n.º 7778-77-0).

A. La electrotransferencia Western se basa en la separación de proteínas por su tamaño en un gel. Sin embargo, la migración de las proteínas a través de la matriz del gel también se ve afectada por otros factores, que pueden provocar que el tamaño de la banda observada sea diferente del tamaño previsto. Los motivos habituales son:

• Modificación postranslacional; por ejemplo, la fosforilación y la glucosilación aumentan el tamaño de la proteína.
• Escisión postranslacional; muchas proteínas se sintetizan como proteínas precursoras y, a continuación, se escinden para producir la forma activa.
• Multímeros; por ejemplo, la dimerización de una proteína. Generalmente, esto se evita en condiciones de reducción, aunque pueden producirse interacciones potentes en el aspecto de las bandas superiores
• Variantes de empalme; puede producirse un corte y empalme alternativo en proteínas de distinto tamaño que se están produciendo a partir del mismo gen
• Carga relativa; la composición de aminoácidos (cargado frente a no cargado)

R. La tinción Coomassie es probablemente una de las técnicas de tinción de proteínas más reconocidas. Existes dos métodos de tinción Coomassie principales, el Coomassie “clásico” y el Coomassie coloidal desarrollado más recientemente.

• El Coomassie clásico implica la tinción de todo el gel, no solo las proteínas. Al decolorar el gel, se visualizan las proteínas, ya que las proteínas retienen mejor el tinte que el gel. Su sensibilidad (límite de detección) es aproximadamente 100 ng, que hace que la detección de proteínas de baja abundancia sea difícil. Es simple, barato y rápido de llevar a cabo y tiene la ventaja de ser compatible con la espectrometría de masas. Sin embargo, la reproducibilidad es un problema con esta tinción, debido a las complicaciones en la estandarización del paso de decoloración.
• • El Coomassie coloidal es una adaptación de la tinción Coomassie clásica con un tinte Coomassie modificado (G-250 en lugar de R-250). Posee una mayor sensibilidad en comparación con el método Coomassie clásico, con un límite de detección de aproximadamente 10 ng. Es fácil de llevar a cabo y puesto que el tinte coloidal no penetra en el gel, no es necesario decolorar (aunque puede realizarse para mejorar el fondo). Al igual que con el método Coomassie clásico, es compatible con la espectrometría de masas.

Además de la tinción Coomassie, la tinción con plata es otro método popular para visualizar proteínas. La principal ventaja de la tinción con plata es su alta sensibilidad, ya que puede detectar menos de 1 ng de proteína, lo que la convierte en la tinción preferida para la detección de proteínas de baja abundancia. Sin embargo, la tinción con plata lleva bastante tiempo y es laboriosa. El gel necesita desarrollo después de la tinción, para visualizar las proteínas, y la duración del desarrollo puede variar considerablemente entre los geles, lo que complica la reproducibilidad. La tinción con plata también implica el uso de formaldehído al fijar el gel, que lo hace incompatible con la espectrometría de masas.

R. Sí, es posible teñir con tinte Coomassie o Coloidal Azul antes de la electrotransferencia Western, aunque puede producirse una transferencia reducida y posterior eficiencia de sondeo. Sin embargo, es importante tener en cuenta que, generalmente, esto solo se recomienda probarlo si utiliza un tinte coloidal. Para garantizar una eficiencia de transferencia óptima, decolore el gel y, a continuación, equilíbrelo en una serie de soluciones de Tris base/glicina/SDS para aumentar la solubilidad. Cuando finalice la transferencia, la membrana debe tratarse con metanol para eliminar el tinte antes del desarrollo cromogénico (no es necesario antes de la detección por quimioluminiscencia).

R. Aquí se muestran algunas opciones para obtener una transferencia eficiente en el caso de proteínas grandes:

1. Equilibre previamente el gel con 0,02-0,04 % de SDS en un tampón de transferencia 2X sin metanol durante 10 minutos antes de montar el intercalado
2. Aumente el tiempo de electrotransferencia de forma gradual (en intervalos de 15 minutos)
3. Añada 0,01 % o 0,02 % de SDS al tampón de transferencia para facilitar la migración de la proteína fuera del gel
4. Reduzca el contenido de metanol en el tampón de transferencia
5. Cambie a un gel adecuado de menor porcentaje. Un gel de menor porcentaje puede permitir realizar una mejor transferencia que un gel de mayor porcentaje

R. Hay dos factores que se deben tener en cuenta: la baja transferencia y el paso de la escalera a través de la membrana durante la transferencia. Para la baja transferencia en la membrana, tenga en cuenta lo siguiente:

• El porcentaje de acrilamida debe ser un 8 % para obtener una transferencia rápida y más completa de proteínas de alto peso molecular
• Aumente la tensión, la corriente o la duración de la transferencia
• Para la transferencia a PVDF, omita el SDS del tampón de transferencia. La adición de SDS (o uso del tampón antiguo que puede tener SDS sometido a lixiviación a partir del gel) provocará que las proteínas se unan de forma menos eficiente a las membranas PVDF debido a que inhibe la interacción hidrofóbica entre la membrana y la proteína
• Si el problema es que la proteína se queda en el gel, tenga en cuenta lo siguiente:
  • Aumente la concentración de SDS a 0,1 % (pero utilice nitrocelulosa)
  • Elimine el metanol del tampón de transferencia
  • Reduzca el porcentaje de acrilamida
  • Realice la transferencia durante más tiempo

Si la escalera pasa por la membrana durante la transferencia:
• Reduzca la tensión o transfiera
• Compruebe la concentración de SDS y metanol. Demasiado SDS puede evitar la unión a la membrana. El alcohol mejora la unión hidrofóbica a la membrana; una cantidad de alcohol insuficiente puede impedir la unión
• Utilice un tamaño de poro de 0,2 µm de nitrocelulosa
• Compruebe el porcentaje de gel; las proteínas más pequeñas pasarán a través de las membranas más fácilmente

R. El tampón utilizado más habitualmente es el tampón RIPA con SDS. La formulación habitual es la siguiente: 150 mm de NaCL, 10 mm de Tris, pH de 7,2, 0,1 % de SDS, 1,0 % de Triton X-100, 1 % de desoxicolato, 5 mm de EDTA. Inhibidores de proteasa: 1 mm de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 10 mm de benzamidina, 2 μg/ml de leupeptina. Inhibidores de fosfatasa: 100 mm de ortovanadato de sodio, 10 mm de p-nitrofenilfosfato

Procedimiento:
1. Colocar las células sobre hielo
2. Lavar las células con PBS helado para eliminar los medios
3. Añadir 1 ml de tampón RIPA a una placa de 100 mm. Ampliar o reducir, según sea necesario
4. Raspar las células en el tampón RIPA y transferir a un pequeño tubo de centrífuga
5. Dejar sobre hielo durante 10 minutos, girar vorticialmente unos minutos para disolver el material. Los lisados también se pueden pasar a través de una aguja de calibre 22 para facilitar la solubilización
6. Centrifugar a 17 000 rpm durante 10 minutos
7. Retirar el sobrenadante para ensayos de proteínas y descargar el sedimento

NOTA: Para experimentos en los que no se desea la desnaturalización total de proteínas y posible rotura de las interacciones proteína:proteína, el tampón RIPA puede reemplazarse por un tampón de solubilización NP40 sin desnaturalización. Receta: 150 mm de NaCL, 20 mm de Tris, pH de 7,5, 1 % de NP40 o 1 % de Triton-X-100 y 5 mm de EDTA. Si se utiliza este tampón sin desnaturalización, los lisados deben homogeneizarse o pasarse a través de una aguja varias veces para garantizar una correcta solubilización.

R. Optimice la concentración de los anticuerpos principales y secundarios. En algunos casos, aumentar la concentración del agente de bloqueo (BSA o leche en polvo desnatada) reduce la señal de fondo. Después de la incubación con el anticuerpo principal, lave al menos dos veces con TBST (incluya 0,5 m de NaCl en uno o varios de los pasos de lavado). Evite el uso de Nonidet™ P40 o Triton™ X-100 en los tampones, ya que estos detergentes se reducen debido a la detección de proteína.

R. Sí, Ref. 12737119 (albumina sérica bovina, fracción V tratada con choque térmico), puede utilizarse en una serie de aplicaciones de biología molecular, entre las que se incluyen las técnicas de electrotransferencia Western (como agente de bloqueo) y ELISA, y como estabilizador para reacciones enzimáticas. Otro producto de BSA nuevo que podría tener en cuenta es el Ref. 12871630 (BSA, tratado con choque térmico y sin proteasa). El uso de este producto ha resultado ser excelente en RIA y ELISA, así como agente de bloqueo.

A. Para el almacenamiento, después de la transferencia, deje secar al aire la mancha y colóquela entre dos hojas limpias de papel de filtro. Coloque el intercalado de papel de filtro y mancha entre dos hojas de tarjeta, con el fin de mantenerlo plano, y colóquelo en una bolsa de plástico sellable. La mancha puede almacenarse a 4 °C hasta dos semanas, a –20 °C hasta dos meses o de forma indefinida a –80 °C. Cuando esté lista para volver a examinarse, rehumedezca la mancha con alcohol durante unos segundos, seguido de unos enjuagues con agua pura para reducir la concentración de alcohol.

Para eliminar los reactivos de la mancha:
• En una campana extractora, sumerja la mancha en un tampón de eliminación de reactivos (100 mm de ß-mercaptoetanol, 2 % de SDS, 62,5 mm de Tris-HCl, pH de 6,7) e incúbela a 50 °C durante 30 minutos con alguna agitación ocasional
• Lave 2 veces durante 10 minutos en TBS-T/PBS-T a temperatura ambiente
• Bloquee la membrana mediante la inmersión en 5 % de reactivo de bloqueo TBS-T o PBS-T durante 1 hora a temperatura ambiente
• Continúe con la siguiente ronda de inmunodetección

Normalmente no necesitará condiciones tan duras para eliminar los anticuerpos de las proteínas. Un método alternativo y más suave para eliminar los reactivos de una mancha es reducir el pH del tampón de eliminación de reactivos.
• Sumerja la mancha en un tampón de eliminación de reactivos (1 % de SDS, 25 mm de glicina-HCl, pH de 2,0) e incúbela a 50 °C durante 30 minutos con alguna agitación ocasional
• Lave 2 veces durante 10 minutos en TBS-T/PBS-T a temperatura ambiente
• Bloquee la membrana mediante la inmersión en 5 % de reactivo de bloqueo TBS-T o PBS-T durante 1 hora a temperatura ambiente
• Continúe con la siguiente ronda de inmunodetección

R. Potencia (W) = Tensión (V) × Corriente
Resistencia (Ω) = Tensión (V) / Corriente (A)

R. La resistencia de una unidad de electroforesis depende de su tamaño, el grosor del gel, la cantidad de tampón, y la conductividad y la temperatura del tampón. Esta resistencia se reducirá normalmente con el tiempo debido al paulatino aumento de la temperatura. Las unidades de electroforesis que tienen una resistencia por debajo de la resistencia de carga mínima de una fuente de alimentación desencadenarán una alarma. Lea la tensión de salida y la corriente durante un análisis para medir la resistencia y utilice la fórmula anterior para calcular el valor.

R. O bien sus parámetros programados no son iguales a los descritos, o bien la resistencia de su unidad de electroforesis es diferente (véase anteriormente). No puede ser debido a, por ejemplo, otro modelo de fuente de alimentación, ya que cualquier instrumento monitoriza las relaciones entre tensión, corriente, potencia y resistencia de la misma forma.

R. Si las tomas de corriente están en paralelo, cada unidad de electroforesis recibirá exactamente la misma tensión. Sin embargo, la corriente y la potencia pueden variar debido a diferencias existentes entre ellas incluso cuando se utilizan exactamente el mismo modelo, gel, tampones, etc. Por lo tanto, se recomienda analizar varias unidades de electroforesis únicamente en el modo de tensión constante en la misma fuente de alimentación.

R. La electroforesis a altas tensiones produce calor. Además, los tampones de alta conductividad como el TAE generan más calor que los tampones de baja conductividad. Debe prestarse atención a la electroforesis en gel de agarosa con tensiones superiores a 175 V, ya que la acumulación de calor puede generar artefactos de gel como frentes de migración con forma de S, y en análisis de electroforesis prolongados se puede incluso fundir el gel de agarosa. Con la electroforesis de alta tensión, debe evitarse el uso de geles de agarosa con un punto de fusión bajo.

R. Hay distintos electrodos apropiados, pero lo esencial es que se trate de un electrodo con "unión doble". Consulte la "Guía de selección de electrodos" en la página 26 para más información.

R. No todos los electrodos son adecuados para todo tipo de muestras. Consulte la "Guía de selección de electrodos de pH" en la página 26 para más información, o póngase en contacto con nuestro servicio de Product Support.

R. Los electrodos estándar utilizan iones de plata en su sistema de referencia. Las proteínas, los tampones Tris y las muestras biológicas generales reaccionan con iones de plata, y esta reacción puede reducir la vida útil del electrodo.

R. Deben utilizarse siempre soluciones tampón limpias (preferiblemente homologadas con respecto a una norma reconocida). También debe considerarse la antigüedad de los electrodos. Los electrodos tienen una vida útil aproximada de entre 6 meses y un año, y deben tratarse como consumibles.

R. Para asegurarse de obtener lecturas precisas y fi ables, recomendamos realizar siempre la calibración en tres tampones de pH, normalmente con un pH de 4, 7 y 10. No obstante, en función de la precisión que necesite, puede realizar una calibración de dos puntos de pH (por ejemplo, 4 y 7 ó 7 y 10) o de hasta cinco puntos con los medidores accumet de Fisherbrand. Puntos importantes que deben recordarse al seleccionar los tampones de pH: deben abarcar el intervalo de pH habitual previsto para sus muestras, y nunca debe calibrarse en puntos con una diferencia de más de 3 unidades de pH (por ejemplo, calibrar con pH 4 y 10 no ofrecerá buenos resultados). Calibre siempre con pH 7.

R. El medidor debe calibrarse regularmente utilizando soluciones tampón limpias. Si se utiliza con una frecuencia diaria/semanal, debe calibrarse antes de cada uso. Si el medidor se usa de forma continua a diario, se recomienda calibrarlo a a mitad de la sesión de trabajo de cada día, como parte de una rutina de calibración.

R. El valor del pH de cualquier muestra varía con la temperatura, de modo que para obtener lecturas precisas lo mejor es medir también la temperatura. Si está midiendo a una temperatura distinta a la de calibración, una sonda de compensación térmica automática podría resultarle útil, o un electrodo con una sonda de este tipo integrada. Los medidores de pH modernos ajustan el valor de la pendiente del electrodo cuando cambia la temperatura, garantizando la precisión de las lecturas.

R. Normalmente sí. Para electrodos de pH estándar, la mayoría de los fabricantes utiliza actualmente una conexión "BNC" entre el electrodo y el medidor. No obstante, esto puede ser un problema cuando se utiliza una sonda de compensación térmica automática, ya que estos conectores no están normalizados y son específi cos de cada fabricante.

R. Con la mayor frecuencia posible. La limpieza y el correcto mantenimiento del electrodo prolongan su vida útil. Tenga cuidado de no dejar el electrodo sumergido en soluciones de limpieza agresivas después de limpiarlo, ya que podría dañarse. Medidas esenciales:

• No reutilice nunca las soluciones tampón
• No abrillante nunca el bulbo
• No almacene nunca el electrodo seco o en agua desionizada
• No agite nunca la muestra ni las soluciones tampón con el electrodo
• No tape nunca el orifi cio de llenado de referencia durante la medición
• Cambie regularmente la solución de llenado de referencia

R. Sí, es posible. En este caso lo importante es la constante de la celda de conductividad (también denominada valor "K"). Para muestras de agua pura se necesita una constante de celda de 0,1. Cada constante de celda tiene un intervalo de detección limitado, por lo que debe asegurarse de seleccionar un intervalo cuyo valor incluya la conductividad prevista para su muestra. Más abajo se ofrecen ejemplos de tipos de muestras, valores de conductividad aproximados y constantes de celda apropiadas:

R. Actualmente no hay una conexión estándar para medidores y celdas de conductividad y cada fabricante utiliza un sistema distinto. Por lo tanto, se recomienda utilizar celdas de conductividad de la misma marca que el medidor.

R. La temperatura puede repercutir signifi cativamente en la conductividad. Al aumentar la temperatura, obviamente se ven afectadas las propiedades químicas de las soluciones acuosas. A su vez, esto infl uye en la conductividad de la solución. Normalmente, la conductividad varía entre 1 y 3% por grado centígrado (ºC)

R. Las celdas de conductividad tienen requisitos de almacenamiento mínimos con respecto a otros tipos de electrodos. Pueden almacenarse en agua desionizada entre mediciones. Para almacenarlas durante la noche, basta con enjuagarlas en agua desionizada y guardarlas secas.

R. De forma frecuente, a ser posible antes de cada uso (como parte de un rutina de calibración diaria, por ejemplo).

R. En el contexto de la ciencia de mediciones, la trazabilidad es el resultado de una medición que puede trazarse a una autoridad nacional, tal como el Instituto nacional de normas y tecnología (NIST), una agencia gubernamental estadounidense perteneciente al departamento de comercio . En concreto, existe una relación válida reconocida con estándares reconocidos nacional o internacionalmente y una cadena intacta profusamente documentada de referencia a la autoridad de medición. El certifi cado de calibración ISO 17025 incluido de serie con los aparatos está reconocido en todos los países europeos.

R. Cada producto Traceable™ se serializa, calibra y certifi ca de forma individual. Un certifi cado de calibración Traceable™ de serialización individual garantiza que un auditor independiente ha comprobado los métodos, los procedimientos, el sistema de prueba, la técnica y las prácticas de conservación de la información del laboratorio de pruebas de calibración. La Asociación Americana de Acreditación de Laboratorios (A2LA) está ampliamente reconocida en todo el mundo a través de acuerdos bilaterales y multilaterales y por su participación en la Acreditación de Laboratorios Internacional (ILAC) y el Acuerdo de Reconocimiento Multilateral (MRA). No es necesario realizar una calibración local de las unidades antes del uso, puesto que todos los organismos ofi ciales pertinentes reconocen y aceptan el certifi cado de calibración Traceable™.

R. Los aparatos están calibrados durante dos años desde la fecha de calibración. En general, tras el envío y almacenamiento de los productos, cabe esperar un periodo mínimo de un año.

R. La precisión indica la exactitud del instrumento en relación a una temperatura conocida. Puesto que es altamente improbable que algo sea preciso con total exactitud, normalmente se incluye una referencia a un valor de tolerancia. La tolerancia indica el valor de imprecisión inherente al instrumento. Por ejemplo, si un instrumento tiene un valor de precisión de ±1°C, signifi ca que la pantalla de la unidad puede mostrar hasta 1°C por encima o por debajo de la temperatura real medida y mantenerse dentro de los límites de tolerancia y precisión indicados para el instrumento.

R. La resolución de un instrumento es el valor más pequeño que se ve en la pantalla. De este modo, si un instrumento tiene una resolución de 0,1°C signifi ca que ofrecerá una lectura hasta el valor de 0,1°C más próximo (por ejemplo 8,6°C) en la pantalla, mientras que un instrumento con una resolución de 1°C leerá hasta el valor de 1°C más próximo (9°C).

R. Ninguno de los productos Traceable™ de Fisherbrand necesita una nueva calibración o certifi cación tras cambiar la pila. Estos instrumentos son trazables a las normas de NIST y el certifi cado de calibración ISO 17025 incluido de serie con los aparatos está reconocido en todos los países europeos.

R. Sí, hay cucharas de repuesto, nº de cat. 15388764 de Fisher Scientifi c. Ésta es la cuchara de repuesto estándar, de 30 ml. Hay otra cuchara de repuesto de mayor tamaño, de 40 ml, nº de cat. 15398764 de Fisher Scientifi c.

R. Mín/Máx son las lecturas de temperatura de nivel más bajo (mínimo) y de nivel más alto (máximo) alcanzados desde que se borró la memoria del termómetro por última vez; estos valores NO pueden confi gurarse. En algunos instrumentos, pueden programarse alarmas de valores MÁX y MÍN, de forma que si la temperatura que está midiendo supera o no alcanza los valores confi gurados, se activará una alarma. Algunos termómetros también incluyen lecturas DENTRO/FUERA. Las temperaturas DENTRO/FUERA se refi eren a sensores distintos, DENTRO es la temperatura que mide el sensor interno de la unidad y FUERA es la que mide la sonda externa.

R. Las sondas de frasco son útiles para su uso en refrigeradores, en los que es probable la puerta se abra con cierta frecuencia. La sonda sellada dentro del frasco indica la temperatura del producto dentro del refrigerador en lugar de la temperatura del aire, que se vería rápidamente afectada por la apertura de la puerta. La sonda de vacuna responde a un concepto similar, pero tiene dimensiones parecidas a las de la mayoría de los frascos de vacunas. Esto ayuda a ofrecer una indicación precisa de la temperatura de la vacuna almacenada.

R. Los frascos de las sondas están llenos con solución de glicol no tóxica, determinada como GRAS (generalmente considerada inocua) por la FDA estadounidense.

R. Los distintos productos ‘Ultra’ de la gama Traceable™ se calibran con una precisión de 0,4°C en puntos de calibración testados. También disponemos de instrumentos de 'precisión extrema'. Éstos se calibran con una precisión de ±0,05 en un intervalo de 2°C de los puntos testados. Están disponibles para los puntos testados habituales de 0°C, 25°C y 37°C. Además, los termómetros de alta precisión de platino tienen una precisión de f ±0,1°C en el intervalo de temperatura completo.

R. Si el termómetro ofrece lecturas imprecisas, la pantalla se ve borrosa o no se ve, signifi ca que es necesario cambiar las pilas. En la mayoría de los casos, al cambiar la pila el termómetro funcionará de nuevo correctamente.

R. Cuando compare las lecturas de dos termómetros, debe sumar las tolerancias de ambos para identifi car la variación total que pueden acumular entre ambas y considerarse aún dentro de los valores especifi cados. Por ejemplo, al comparar dos modelos del mismo termómetro con una precisión de ±0,1°C, ambos pueden indicar temperaturas con una diferencia de hasta 2°C. Al comparar temperaturas de termómetros distintos, es importante que el tipo de sondas comparadas sea equivalente.

R. Prácticamente todos los viales Fisherbrand se fabrican a partir de vidrio de primera clase hidrolítica. El vidrio de clase hidrolítica presenta gran dureza y un coeficiente de expansión muy bajo, incluso con variaciones muy altas de temperatura. Muestra una excelente resistencia química a soluciones ácidas y neutras, e incluso a soluciones alcalinas, gracias a su contenido relativamente bajo en álcalis.

R. Todos los viales que presentan la etiqueta CleanPack en la parte frontal de la caja de polipropileno han sido envasados en una sala limpia certificada tras pasar por el horno de recocido a aproximadamente 600 °C. La presencia de la etiqueta “CleanPack” expresa la garantía de disponer de elementos limpios y sin contaminación para realizar análisis fiables y precisos. Asimismo, el material retráctil en el fondo revela cualquier intento de manipulación no autorizada de la caja de polipropileno, y su cubierta permite volver a sellar el envase en cualquier momento durante el consumo del producto para evitar la contaminación de los viales durante el uso.

R. Los viales silanizados se utilizan para reducir la adsorción de compuestos polares sobre la superficie normalmente polar del recipiente de vidrio. Algunos compuestos, tales como aminoácidos, proteínas o fenoles, tienden a reaccionar con los grupos OH del vidrio incluso si, como suele ocurrir en cromatografía, se utiliza vidrio de primera clase hidrolítica. El proceso de silanización permite desactivar la superficie y eliminar las posibles reacciones entre los compuestos polares y el vidrio.

R. La elección de los septum correctos depende de la aplicación. Prácticamente todos los septum están laminados en un lado con PTFE, que ofrece una alta resistencia química y establece una barrera inerte entre la muestra y el material portador. Los materiales portadores presentan diferentes propiedades físicas y químicas, como por ejemplo temperatura, resistencia, propiedades de resellado, limpieza, dureza, grosor, etc. para ayudarle a identificar los septum más adecuados para su intervalo de temperatura y aplicación, consulte la guía correspondiente en la página 13 de este catálogo.

R. Consulte la Tabla 4: compatibilidad química de los materiales de viales y sistemas de cierre, en las páginas 16 y 17 de este catálogo. Esta tabla únicamente se incluye como referencia. Numerosos factores afectan a la resistencia química de los viales y sistemas de cierre y el usuario debe realizar una prueba bajo sus propias condiciones para verificar que el producto utilizado es completamente compatible.

R. La prueba de dureza de los plásticos suele realizarse normalmente mediante la prueba de Shore (durómetro). Este método mide la resistencia a la indentación de los plásticos y ofrece un valor de dureza empírico. La dureza Shore se mide con las escalas Shore “A” o “D”. Este es el método preferible para los cauchos y elastómeros y también se utiliza habitualmente para plásticos más blandos, tales como polioleofinas, fluoropolímeros y vinilo. La escala Shore A se utiliza para cauchos “más blandos”, mientras que la escala “D” se utiliza para los cauchos “más duros”. La mayoría de los valores de dureza de los septum se cubren con la escala Shore A, aunque las durezas de PTFE y polietileno, que se miden con la escala Shore D, representan algunas excepciones. Los resultados obtenidos de esta prueba ofrecen una medición útil de la resistencia relativa a la perforación de diversos grados de polímeros. Esto ofrece una orientación acerca del tipo de aguja que penetrará el septum y si pueden utilizarse agujas de calibre más fino.

R. Las certificaciones son cada vez más importantes para mejorar la reproducibilidad de los procesos y evitar posibles fuentes de errores desde el primer momento. La calidad más alta, la consistencia y el control de calidad siempre han resultado muy importantes y se reflejan en tres certificaciones: “Especificación certificada”, “Kits certificados para HPLC y cromatografía de gases” y “Kits certificados para LC/MS y GC/MS”. Consulte la página 15 de este catálogo si desea obtener información adicional.

R. En la actualidad, generalmente pueden obtenerse tres tipos de sistemas de cierre diferentes para sellar un vial de muestreador automático:

• Tapón para encapsular con diámetro de 8, 11, 13, 20 mm
• Tapón de rosca; 8-425, rosca corta de 9 mm, 10-425, 13-425, 15-425, 18 mm, 24-400, 24-414
• Tapón a presión: 8 mm, 11 mm, 13 mm

Con respecto a la tasa de evaporación, un tapón para encapsular ofrece el sellado más hermético, seguido del tapón de rosca y, a continuación, los tapones a presión. No obstante, los tapones de rosca y los tapones a presión permiten una manipulación más sencilla, ya que no requiere el uso de ningún encapsulador ni descapsulador. Si desea obtener comodidad en la manipulación, junto con la alta integridad y reproducibilidad de la muestra de un vial encapsulado, el vial con anillo de tope de rosca representa la mejor alternativa. Este tipo de vial con rosca no sólo ofrece la tasa de evaporación más baja, sino que también elimina la inclinación del tapón y garantiza menos interrupciones en el muestreador automático debido a errores de manipulación de viales.

Los sistemas de transporte magnético de viales de los muestreadores automáticos actuales requieren el uso de tapones magnetizables. Este tipo de tapones se suministran para encapsular y con rosca.

R. Sin duda alguna, la reutilización o lavado de viales representa un riesgo para la integridad de su muestra, ya que la superficie del vial cambia durante el proceso de limpieza (el grado de adsorción de compuestos críticos aumenta) y no puede garantizarse plenamente la eliminación completa de los analitos anteriores y, en consecuencia, puede ocurrir contaminación cruzada y/o falsos picos. Se recomienda a los cromatógrafos que requieran una integridad absoluta de la muestra que utilicen siempre viales y septum nuevos para cada análisis.

R. El vidrio de borosilicato reduce las posibilidades de contaminación por aducción de metal. De esta forma se asegura la fiabilidad de los cromatogramas, incluso cuando el producto ha estado en uso durante un periodo de tiempo.

R. Los productos Optima™ LC-MS (disolventes, mezclas, aditivos y reactivos) han sido desarrollados específicamente para permitir que los instrumentos más sensibles ofrezcan el máximo rendimiento. Se aplica una prueba de gradiente LC con un detector PDS para garantizar líneas de referencia y fondo suaves. La prueba también garantiza que no haya ninguna impureza de iones positivos o negativos presente. Nuestro proceso de fabricación ha sido desarrollado para minimizar las impurezas, ya que la presencia de aniones de metal y analitos complican el espectro. Se ofrece un producto de grado LC-MS “estándar” para aplicaciones analíticas más rutinarias.

R. La diversidad de requisitos que plantean los usuarios de cromatografía nos ha impulsado a encontrar alternativas para mejorar nuestros procesos de purificación y desarrollar una serie de disolventes y soluciones tampón que cumplen las necesidades de la instrumentación específica. Los grados de disolventes Fisher Chemical han sido desarrollados y probados para optimizar el rendimiento de la cromatografía a través de la selección del grado idóneo para el tipo de instrumento y detector.

Aplicación para cromatografía	Instrumento y tipo de detector	Grado del disolvente de Fisher Chemical
UHPLC-MS	UHPLC acoplado a detector de masa	Optima UHPLC-MS
Grado alto HPLC-MS	LC y UHPLC acoplados a detector de masa	Optima LC/MS
HPLC-MS	LC acoplado a detector de masa	Grado LC-MS
UHPLC	UHPLC acoplado a detector UV	Grado de gradiente UHPLC
Análisis de alto gradiente HPLC	Gradiente LC acoplado a detector UV	Grado de gradiente HPLC avanzado
Análisis de gradiente HPLC	Gradiente LC acoplado a detector UV	Grado de gradiente HPLC
HPLC (isocrático)	LC acoplado a detector UV	Grado HPLC

Asimismo, para respaldar otras técnicas de cromatografía especializadas, ofrecemos también una amplia gama de disolventes especializados que han sido especificados y probados para HPLC:

• Grado de gradiente avanzado con desviación de la línea de referencia muy baja para el desarrollo del método
• Grado HPLC para detección electroquímica
• Grado HPLC para detección de fluorescencia
• Grado GPC (cromatografía de filtración en gel)

R. Fisher Scientific N.° cat. 10596814 se envasa en frascos de HDPE por motivos de seguridad. El uso de un frasco de HDPE evita los peligros asociados a la acumulación de presión derivada del monóxido de carbono, que es un producto de la descomposición natural del ácido fórmico. Los clientes no deben preocuparse acerca de la posible contaminación provocada por plastificantes, ya que se aplica un tratamiento superficial patentado al frasco de HDPE para crear una barrera entre las superficies del frasco y el ácido fórmico y evitar la contaminación. Almacenar este producto a 4 °C para ralentizar este proceso de descomposición natural representa una buena práctica de laboratorio.

El ácido fórmico de grado Optima™ LC-MS también se suministra en ampollas de vidrio de borosilicato de 0,5, 1 y 2 ml, Fisher Scientific N.° cat. 10780320, 10473038 y 10063427, respectivamente. Nota: las ampollas presentan incisiones para facilitar la apertura.

R. No. El almacenamiento temporal bajo condiciones ambiente no afectará al reactivo. No obstante, para almacenamiento a largo plazo, se recomienda nuevamente mantener el producto en condiciones frías de 4 °C para mantener la integridad del producto durante más tiempo.

R. La diferencia principal entre el vidrio de borosilicato y el sodocálcico es la sustitución del óxido cálcico y el óxido sódico por el óxido bórico en el proceso de fabricación. El primero es más resistente y no se expande como el vidrio sodocálcico, lo que significa que puede soportar calor y frío extremos y por ello se utiliza más como material de laboratorio.

R. El material de vidrio se puede esterilizar generalmente en autoclave con seguridad. Cuando esterilice los recipientes de vidrio en autoclave, asegúrese de que las tapas estén abiertas. Si los esteriliza con las tapas cerradas puede haber diferencias de presión y podrían producirse roturas. No caliente nunca material de vidrio que presente marcas, grietas, golpes o rayaduras. Estos fallos reducen la estabilidad térmica y aumentan el riesgo de roturas.

R. Aunque los matraces y Erlenmeyer poseen marcas con una indicación aproximada de volumen, existe una incertidumbre de +/- 5% sobre el volumen exacto que representa la línea de volumen. Existen solo cinco dispositivos de medición volumétricos reconocidos como adecuados para los trabajos analíticos de gran precisión: matraces aforados, probetas de medición, buretas y pipetas volumétricas. Están clasificados en dos grados diferentes, clase A y clase B.

R. El material de vidrio volumétrico de laboratorio, como matraces aforados, probetas de medición, buretas y pipetas volumétricas, se fabrica y calibra siguiendo las normas de la Asociación Americana para el Ensayo y Materiales (ASTM). La ASTM es anterior a otros organismos de normalización como BSI o DIN. Están disponibles en dos grados diferentes, clase A y clase B. Las normas ASTM definen la tolerancia de la posición de las marcas en el vidrio. La clase A es la más precisa, ya que tiene la tolerancia más baja, y en la clase B en general el intervalo de tolerancia es el doble que en la clase A.

R. Las pipetas volumétricas de vidrio de Fisherbrand pertenecen a la clase AS, que desde hace poco sustituye a la clase A. La clase AS es la norma europea y tiene las mismas exigencias de precisión y tolerancia de las correspondientes ISO y DIN que la clase A. Las pipetas serológicas de clase AS también tienen mayor velocidad de dispensación que las de clase A (la S proviene de la palabra alemana "schnell", que significa "rápido"). Como consecuencia de la mayor velocidad de dispensación se debe respetar un tiempo de espera de cinco segundos al llenar o dispensar el volumen necesario. Esto garantiza que el menisco se ha fijado y mantiene su precisión.

R. La limpieza por ultrasonidos es un buen método para limpiar el material de vidrio minuciosamente. Los limpiadores de ultrasonidos con calentadores son los mejores. Generalmente, los limpiadores de ultrasonidos con un detergente suave son capaces de eliminar la mayoría de los residuos del material de vidrio. Cuando utilice un equipo de limpieza para vidrio, asegúrese de que éste está protegido y preste especial atención en el momento de cargarlo y descargarlo, ya que es ahí cuando se suelen producir los resquebrajamientos y roturas.

R. El vidrio ámbar se utiliza en laboratorios para proteger las sustancias químicas y los materiales sensibles de los rayos UV. El vidrio ámbar bloquea todos los rayos UV de 350 a 200 nm. El intervalo UVC utilizado para la eliminación de microorganismos entre 200 y 280 nm también se bloquea. No obstante, el vidrio ámbar no bloquea la totalidad de la radiación UV.

R. Los recipientes de vidrio no tienen fecha de caducidad ni límite de vida útil. No obstante, es importante comprobar regularmente que el material de vidrio no esté dañado, ya que se podrían comprometer la seguridad o la precisión. Si existen daños significativos debe tirar y reemplazar el material.

R. Por regla general, el vidrio puede soportar temperaturas de hasta 500°C. No obstante, cuando la temperatura sobrepasa los 150°C hay que tener especial cuidado y asegurarse de que el calentamiento y el enfriamiento se realizan de forma suave y uniforme. Si utiliza placas calefactoras, compruebe que la parte superior de la placa sea más ancha que la base del recipiente que desea calentar. No ponga nunca material de vidrio frío en placas calefactoras que ya estén muy calientes. Caliéntelas gradualmente desde la temperatura ambiente. Si utiliza un quemador Bunsen, ajústelo para que proporcione una llama pequeña y ancha para calentar el vidrio más despacio e uniformemente. Además, puede usar una malla metálica con centro de cerámica para difundir la llama.

R. No existen directrices definidas sobre el período de tiempo en el que se tiene que volver a calibrar el material de vidrio, ya que depende de la manera en la que se limpie, manipule o almacene. Normalmente, el material de vidrio volumétrico solo necesita volver a calibrarse tras un uso prolongado o intenso, ya que se puede alterar su precisión. Por ejemplo, debe considerar una recalibración en los siguientes casos:

• Cuando el material esté fabricado con vidrio sodocálcico y se haya utilizado durante unos cinco años
• Cuando el material esté fabricado con vidrio de borosilicato y se haya utilizado durante unos cinco años
• Cuando el material de vidrio haya soportado temperaturas de más de 150°C
• Cuando el material haya sido utilizado con frecuencia con ácidos o bases fuertes
• Cuando haya signos de corrosión química, por ejemplo escarchamiento de las superficies internas de cristal

R. La mejor garantía para obtener volúmenes precisos es comprobar que el material esté limpio. En el caso de las buretas o pipetas, la limpieza del material de vidrio se indica por la ausencia de "perlas de agua" en la superficie interior del vidrio. Cuando el artículo está limpio, la solución es una película fina y sin roturas en el interior del material de vidrio. En general, es suficiente con sumergir las pipetas y el material volumétrico de vidrio en una solución templada con detergente durante unos minutos. Evite dejarlos mucho tiempo, ya que en caso de inmersión prolongada con el detergente puede formarse una zona rugosa en la interfaz de aire/ vidrio que puede inutilizar el material. Después de sumergirlo brevemente, unos 2 o 3 minutos, el material de vidrio se debe enjuagar minuciosamente con agua del grifo y al final aplicar 3 o 4 enjuagues con agua destilada o desionizada. No seque el material de vidrio con trapos. Déjelos secar al aire protegidos del polvo. No es necesario secar el vidrio en la secadora, pero si dispone de una, utilícela. No solo se secará más rápido, sino que estará protegido del polvo durante el secado.

R. Los frascos de Fisherbrand no son aptas para aplicaciones con presión y se debe tener cuidado cuando se use material de vidrio para este tipo de aplicaciones. Fisher Scientific no puede garantizar que no exista riesgo de roturas cuando el material se utilice con vacío o presión.

A. Only polypropylene, PTFE, PC and PMP (TPX) products can be autoclaved (autoclave cycle is defined as 121°C at 15psi (1bar) for 20 minutes). When autoclaving bottles always ensure the caps are loosened. Autoclaving with tightly screwed caps can result in collapse or deformation. Also do not subject plastic volumetric ware such as measuring cylinders, flasks etc to temperatures above 60°C as high temperatures can affect volumetric accuracy

R. Tanto el LDPE como el HDPE tienen una temperatura de fragilidad de -100°C, por lo que se pueden utilizar para congelar las muestras demasiado grandes para los crioviales de tamaño estándar. Preste especial atención en comprobar que haya suficiente espacio en el recipiente para que la muestra se expanda. Recomendamos los productos con las referencias N° 11735383, 11775243 y 11957934 de Fisher Scientific.

R. Para aplicaciones en las que la claridad óptica sea importante, los polímeros más apropiados son poliestireno, PET, PMP o policarbonato. Otros polímeros como el polipropileno o el polietileno son translúcidos y en algunos casos opacos, por lo que no son adecuados para este requisito.

R. Para conocer la compatibilidad química de polímeros en particular, consulte la tabla de compatibilidad química en las páginas 14 y 15.

R. Para limpiar la mayor parte del material de plástico se recomienda utilizar un detergente poco o no alcalino. No obstante, tenga en cuenta que los productos de poliestireno y policarbonato son susceptibles a los álcalis y se recomiendan los detergentes neutros. Es importante evitar los limpiadores abrasivos y estropajos, ya que pueden rayar y debilitar las superficies.

R. La elección correcta del tipo de membrana del frasco o vial depende de la aplicación. Casi todas las membranas están laminadas en un lado con PTFE, que tiene una resistencia química elevada y forma una barrera inerte entre la muestra y el material portador. Los materiales portadores tienen diferentes propiedades físicas y químicas, como resistencia a la temperatura, propiedades de resellado, limpieza, dureza, espesor, etc. La guía de la página siguiente le ayudará a identificar el diafragma más adecuado para su aplicación particular.

Las condiciones específicas de su aplicación le ayudarán a elegir las membranas más adecuadas, como se explica a continuación

Como ayuda para que conozca las combinaciones más comunes de membranas del mercado, vea las imágenes a continuación. Tenga en cuenta que los colores no indican necesariamente el tipo de material del revestimiento real.